EMSA凝膠阻滯-DAP-seq

EMSA凝膠阻滯-DAP-seq

EMSA凝膠/電泳遷移率實驗技術服務常見問題

1、EMSA原理及方法

EMSA 稱凝聚阻滯實驗或凝膠電泳遷移率檢測， 是一種用于研究轉錄因子和其相關的 DNA 結合序列相互作用的技術， 能對各類轉錄因子的 DNA 結合活性進行定性和半定量分析，是一項研究細胞信號轉導通路的關鍵實驗技術。

EMSA 主要基于蛋白-探針復合物在在凝膠電泳過程中遷移較慢的原理。根據實驗設計特異性和非特異性探針，當核酸探針與樣本蛋白混合孵育時，樣本中可以與核酸探針結合的蛋白質與探針形成蛋白-探針復合物；這種復合物由于分子量大，在進行聚丙烯酰胺凝膠電泳時遷移較慢，而沒有結合蛋白的探針則較快；孵育的樣本在進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉膜后，蛋白-探針復合物會在膜靠前的位置形成一條帶，說明有蛋白與目標探針有互作。

2、看不到遷移條帶

1）蛋白樣本提取質量不高，蛋白降解或者提取量不足。

2）樣本中沒有可以與探針結合的蛋白。

3）探針與蛋白無特異性的相互作用。

4）轉膜效率低，蛋白或者探針未轉移到膜上。

5）曝光或者成像時間過短。

6) 在 Super-Shift EMSA 測定中看不到 Super-Shift DNA/蛋白復合物帶還可能有以下原因：

a. 抗體沒有工作。不是所有的抗體都可以用于 Super-Shift EMSA，只有對非變性蛋白的表面抗原決定簇起反應的抗體才能夠用于 Super-Shift EMSA。

b. 測定的活化的 DNA/蛋白復合物中沒有希望檢測的構成成分存在。此時既看不到 Super-Shift 的帶，也看不到 DNA/蛋白復合物的量的減少。

c. 使用的抗體過度稀釋。一般 10～20 ul 的反應液需要使用 0.5～1 ul 原倍的抗體。

d. 多抗與 DNA/蛋白復合物形成大的聚集物而不進膠。在這種情況下，雖然看不到 Super-Shift 的帶，但應當可以看到 DAN/蛋白復合物的電泳帶明顯減少。

3、實驗背景高

1）曝光或者成像時間過長。

2）封閉時間不足或者效率不高。

3）洗滌效果不佳。

4）實驗過程中膜沒有一直處于濕潤狀態。

5）蛋白的質量不高，雜質多

4、EMSA如何設置對照實驗及其目的

EMSA實驗會有如下對照組：
(1)陰性對照反應(標記探針)；
(2)常規反應(含激活的目的轉錄因子的核蛋白＋標記探針)；
(3)探針冷競爭反應(含激活的目的轉錄因子的核蛋白＋標記探針＋標記探針100倍量的未標記探針)；
(4)突變探針的冷競爭反應(含激活的目的轉錄因子的核蛋白＋標記探針＋標記探針100倍量的未標記突變探針)；
(5)Super-shift反應(含激活的目的轉錄因子的核蛋白＋標記探針＋目的轉錄因子的特異抗體)。

每個對照組的目的：
(1)確定探針里面是否有雜質，光有探針，沒有其他成分時，探針的位置，應該位于下方。
(2)這個是看蛋白和探針的結合，是實驗目的
(3)看探針結合的特異性。如果冷探針可以競爭結合，阻礙了標記的探針，說明2中的結合是特異的
(4)目的和3相同。突變的冷探針應該對2的結果沒有影響
(5)也是判斷特異性，這次是看蛋白的特異性，和抗體結合后，就會有super-shift。如果沒有，說明是其他的蛋白結合。

5、EMSA非放射性探針設計注意事項

（1）EMSA探針不宜太長，一般是幾十堿基對。太長會產生過多結合位點導致結果分析困難，還會產生超級螺旋結構而掩蓋結合部位

（2）注意AT/GC比例

（3）防止產生空間位阻

（4）防止錯位配對、封閉成環，排除目標序列以外結合位點

（5）推薦Biotin或紅外熒光標記，盡量不要用DIG標記。