葡萄（Vitis spp.）是一種在全球范圍內(nèi)廣泛種植的重要經(jīng)濟(jì)型作物。目前，大多數(shù)栽培葡萄屬于歐亞種葡萄（Vitis vinifera），該品種對白粉病高度敏感。白粉病可侵染葡萄所有綠色器官，并在整個生長季持續(xù)危害，嚴(yán)重降低果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)。目前主要依賴化學(xué)殺菌劑進(jìn)行防治，成本高昂且會給社會經(jīng)濟(jì)和環(huán)境帶來負(fù)面影響。因此，培育抗病品種是一種更可持續(xù)的解決方案。鑒定白粉病抗性基因至關(guān)重要，可為通過基因工程手段培育抗病品種提供關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2025年6月18日，西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院王西平教授課題組在Plant Biotechnology Journa（IF=10.5）發(fā)表了題為“A module with multiple transcription factors positively regulates powdery mildew resistance in grapevine"的研究論文。該研究借助DAP-seq技術(shù)揭示了中國野生毛葡萄通過VqLIMYB-VqWRKY46/VqNF-YC9-VqDSC1信號模塊調(diào)控白粉病抗性的分子機(jī)制，為葡萄抗病分子育種提供了新的理論基礎(chǔ)。

技術(shù)路線

研究發(fā)現(xiàn)，VqWRKY46是葡萄白粉病正調(diào)控因子，借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)基因體系，成功獲得VqWRKY46過表達(dá)株系和干擾株系。接種葡萄白粉菌9 d后，與野生型（WT）相比，過表達(dá)植株表現(xiàn)出分生孢子數(shù)量減少、菌絲長度縮短，同時伴隨胼胝質(zhì)積累增加、過氧化氫含量升高及HR反應(yīng)增強(qiáng)等現(xiàn)象，以及防御相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)；而干擾植株的表型則呈現(xiàn)相反趨勢。上述結(jié)果證實(shí)，VqWRKY46正向調(diào)控葡萄對白粉菌的抗性。

圖1. VqWRKY46增強(qiáng)葡萄對白粉病的抗性。

為探究VqWRKY46的上游調(diào)控機(jī)制，該研究通過酵母單雜交（Y1H）文庫篩選，鑒定到轉(zhuǎn)錄因子VqLIMYB。生物信息學(xué)分析顯示，VqWRKY46啟動子區(qū)域存在MYB家族轉(zhuǎn)錄因子的典型結(jié)合基序（Myb motif: CAGTTA）。Y1H試驗(yàn)證實(shí)，VqLIMYB可特異性結(jié)合該啟動子區(qū)域。進(jìn)一步的凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（EMSA）表明，VqLIMYB與Myb motif元件的直接互作具有序列特異性。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)（DLR）及GUS活性檢測結(jié)果顯示，VqLIMYB可顯著增強(qiáng)VqWRKY46啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。上述結(jié)果表明，VqLIMYB通過直接結(jié)合VqWRKY46啟動子上的Myb motif元件，激活其表達(dá)。通過瞬時轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得VqLIMYB過表達(dá)和缺失轉(zhuǎn)基因植株（OE-VqLIMYB、RNAi-VqLIMYB），接種白粉菌后的表型分析顯示，VqLIMYB過表達(dá)顯著增強(qiáng)葡萄對白粉病的抗性。

圖2. VqLIMYB直接與VqWRKY46啟動子的Myb motif（CAGTTA）結(jié)合并激活其表達(dá)。

為解析VqWRKY46的互作蛋白網(wǎng)絡(luò)，利用酵母雙雜交（Y2H）文庫篩選獲得轉(zhuǎn)錄因子VqNF-YC9。通過Y2H驗(yàn)證、雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）、分裂熒光素酶互補(bǔ)（Split-LUC）、Pull-down及熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET-AB）等試驗(yàn)，證實(shí)VqWRKY46與VqNF-YC9存在直接互作。此外還發(fā)現(xiàn)，VqWRKY46與VqNF-YC9均可通過自身互作形成同源二聚體。

圖3. VqWRKY46與VqNF-YC9存在物理相互作用。

進(jìn)一步研究表明，VqNF-YC9啟動子區(qū)域含有3種典型的WRKY結(jié)合基序W-box（Wbox1: TTGACC；Wbox2: TTGACT；Wbox3: TTGACA）。通過Y1H、EMSA及DLR試驗(yàn)，證實(shí)VqWRKY46可直接結(jié)合上述W-box元件并激活VqNF-YC9的轉(zhuǎn)錄。實(shí)時熒光定量PCR（RT-qPCR）分析顯示，VqNF-YC9在VqWRKY46過表達(dá)株系中的表達(dá)量顯著高于野生型（WT），而在干擾株系中表達(dá)量則呈下調(diào)趨勢。上述結(jié)果表明，VqWRKY46與VqNF-YC9之間存在雙重調(diào)控關(guān)系：既能通過蛋白互作形成功能復(fù)合體，又能通過靶向啟動子W-box元件調(diào)控VqNF-YC9的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而構(gòu)成多層次協(xié)同調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過瞬時轉(zhuǎn)化獲得VqNF-YC9過表達(dá)和缺失轉(zhuǎn)基因植株（OE-VqNF-YC9、RNAi-VqNF-YC9），接種白粉菌后的表型分析表明，VqNF-YC9過表達(dá)可顯著增強(qiáng)葡萄對白粉病的抗性。

圖4. VqWRKY46特異性結(jié)合VqNFYC9啟動子中的三個典型的W-box。

為深入鑒定VqWRKY46的直接靶基因，作者采用DNA親和純化測序技術(shù)（DAP-seq）進(jìn)行分析，共鑒定到416個重疊結(jié)合峰，其中約28%定位于啟動子區(qū)域。基序富集分析顯示，核心順式元件為典型W-box（TTGACC/T）。重點(diǎn)關(guān)注到抗病基因VqDSC1，其啟動子區(qū)域含有3個Wbox1（TTGACC）和4個NF-YC類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)CCAAT。通過Y1H、EMSA及DLR實(shí)驗(yàn)，證實(shí)VqWRKY46可特異性結(jié)合Wbox1并激活VqDSC1轉(zhuǎn)錄；而VqNF-YC9雖無法直接結(jié)合CCAAT位點(diǎn)，但與VqWRKY46互作后可顯著增強(qiáng)其對VqDSC1啟動子的激活作用。RT-qPCR結(jié)果顯示，VqDSC1在VqWRKY46過表達(dá)株系中顯著上調(diào)，在干擾株系中顯著下調(diào)，且其表達(dá)受白粉菌誘導(dǎo)顯著增強(qiáng)。功能驗(yàn)證表明，瞬時過表達(dá)VqDSC1（OE-VqDSC1）可誘導(dǎo)超敏反應(yīng)（HR）并增強(qiáng)葡萄白粉病抗性，而干擾株系（RNAi-VqDSC1）則表現(xiàn)出感病表型。

圖5. 使用DNA親和純化和測序（DAP Seq）技術(shù)檢測VqWRKY46在全基因組范圍內(nèi)的結(jié)合序列和靶基因。

綜上，該研究揭示VqWRKY46與VqNF-YC9通過形成同源二聚體及蛋白復(fù)合體的雙重機(jī)制，協(xié)同調(diào)控VqDSC1的表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)葡萄白粉病抗性。研究最終闡明了VqLIMYB-VqWRKY46/VqNF-YC9-VqDSC1信號模塊的抗病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為葡萄抗病分子育種提供了關(guān)鍵基因靶點(diǎn)及理論支撐。

圖6. VqLIMYB-VqWRKY46/VqNF-YC9-VqDSC1正向調(diào)控葡萄白粉病抗性模型。