一、技術(shù)原理

在植物科學(xué)的研究中，解析轉(zhuǎn)錄因子與DNA的互作機(jī)制，是構(gòu)建基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的ChIP-seq技術(shù)依賴高質(zhì)量特異性抗體，這一局限性使非模式植物的研究面臨巨大挑戰(zhàn)。DAP-seq（DNA Affinity Purification Sequencing，DNA親和純化測(cè)序）技術(shù)的出現(xiàn)，為研究模式和非模式植物基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，提供了高效解決方案。DAP-seq的原理是通過體外表達(dá)出含有標(biāo)簽（如His、Halo標(biāo)簽）的目的蛋白，并將其與標(biāo)簽特異性配體結(jié)合，然后富集DNA，使用高通量測(cè)序與生物信息學(xué)分析，在全基因組范圍內(nèi)鑒定轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)（TFBS）。該技術(shù)無需目的蛋白特異性抗體，無需轉(zhuǎn)基因材料，即可揭示轉(zhuǎn)錄因子與DNA的互作網(wǎng)絡(luò)，已成為植物學(xué)、微生物學(xué)等領(lǐng)域解析基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵技術(shù)手段。

藍(lán)景科信DAP-seq技術(shù)路線圖

二、技術(shù)優(yōu)勢(shì)

1. 不依賴目的蛋白特異性抗體

無需目標(biāo)蛋白特異性抗體，僅需標(biāo)簽配體，即可完成對(duì)DNA的富集，尤其適合缺乏抗體的非模式生物。

2. 無需構(gòu)建轉(zhuǎn)基因材料

通過體外表達(dá)系統(tǒng)高效生產(chǎn)目的蛋白，解除了內(nèi)源蛋白表達(dá)量低、組織特異性表達(dá)或其他因子干擾的限制。

3. 適用于不同物種

藍(lán)景科信已將DAP-seq成功應(yīng)用于200多個(gè)物種，涵蓋植物、動(dòng)物、真菌及細(xì)菌。實(shí)驗(yàn)流程可根據(jù)物種特性靈活優(yōu)化。

4. 雙DNA親和純化測(cè)序（dDAP-seq）技術(shù)

能夠在體內(nèi)基因組背景下繪制相互作用轉(zhuǎn)錄因子（二聚體）的全基因組結(jié)合位點(diǎn)，為研究轉(zhuǎn)錄因子相互作用如何調(diào)節(jié)結(jié)合特異性、潛在靶基因和生物學(xué)功能提供了有力工具。

三、技術(shù)發(fā)展與影響力

自2016年DAP-seq在《Cell》發(fā)表，2017年實(shí)驗(yàn)方法在《Nature Protocols》正式發(fā)布后，DAP-seq迅速成為解析轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵技術(shù)。截至目前，藍(lán)景科信使用該技術(shù)，已助力科學(xué)家在植物生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫響應(yīng)、果實(shí)發(fā)育、系統(tǒng)進(jìn)化等多個(gè)研究方向取得突破，相關(guān)研究成果發(fā)表于Cell、Molecular Plant、Plant Biotechnology Journal、Plant Cell、PNAS、Plant Communications、New Phytologist、Plant Physiology等期刊。

四、藍(lán)景科信實(shí)戰(zhàn)案例：DAP-seq在高分文章中的應(yīng)用

應(yīng)用場(chǎng)景一：解析植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

案例1：DAP-seq助力解析擬南芥WRKY1轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)一次結(jié)實(shí)衰老的分子機(jī)制

發(fā)表時(shí)間：2024年7月

期刊：Cell（IF=17.1）

題目：Arabidopsis WRKY1 promotes monocarpic senescence by integrative regulation of flowering, leaf senescence and nitrogen remobilization

研究背景：

一次結(jié)實(shí)衰老在種子植物中普遍存在，影響作物收獲時(shí)間和品質(zhì)，但外界和內(nèi)部信號(hào)如何系統(tǒng)性整合調(diào)控該過程的機(jī)制尚不明確，尤其是WRKY轉(zhuǎn)錄因子在其中的作用有待探究。

主要結(jié)果：

研究發(fā)現(xiàn)，WRKY1的表達(dá)受年齡、水楊酸（SA）和氮缺乏誘導(dǎo)，其過表達(dá)株系（WRKY1-OE）表現(xiàn)為開花提前和葉片早衰，而wrky1突變體則延遲開花和衰老。通過DAP-seq與RNA-seq聯(lián)合分析，鑒定出WRKY1的直接靶基因：

1. 開花調(diào)控：WRKY1直接結(jié)合開花抑制基因FLC的啟動(dòng)子（如W1-W3位點(diǎn)），抑制其表達(dá)，從而激活FT和SOC1，促進(jìn)開花轉(zhuǎn)換。 

2. 葉片衰老調(diào)控：WRKY1靶向SA生物合成基因SID2和PBS3的啟動(dòng)子（如SID2的W2/W4、PBS3的W1-W3位點(diǎn)），激活SA合成，加速葉片衰老。 

3. 氮素再分配調(diào)控：WRKY1結(jié)合氮同化基因NIA1、NRT3.1等的啟動(dòng)子，增強(qiáng)硝酸鹽還原酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)氮從衰老葉片向種子的再分配。 

本文通過DAP-Seq在全基因組范圍內(nèi)鑒定出擬南芥WRKY1轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)以及保守結(jié)合基序，系統(tǒng)性揭示了WRKY1在單稔衰老中的靶基因網(wǎng)絡(luò)，特別是其對(duì)SA生物合成、氮代謝和FLC開花通路的直接調(diào)控。這些結(jié)果通過ChIP-qPCR、EMSA、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)及遺傳分析等多維度驗(yàn)證，形成了“結(jié)合預(yù)測(cè)-分子互作-功能表型"的完整證據(jù)鏈，為闡明WRKY1調(diào)控單次結(jié)實(shí)衰老機(jī)制提供了關(guān)鍵依據(jù)。

案例2：DAP-seq助力揭示葉綠體生物發(fā)生的調(diào)控機(jī)制

發(fā)表時(shí)間：2024年7月

期刊：Cell（IF=45.5）

題目：MYB-related transcription factors control chloroplast biogenesis

研究背景：

葉綠體生物發(fā)生對(duì)植物光合作用至關(guān)重要，已知GLK家族轉(zhuǎn)錄因子是主要調(diào)控因子，但其單基因突變體仍有殘留葉綠素，暗示存在其他協(xié)同調(diào)控因子，而MYB相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在葉綠體發(fā)育中的作用及其與GLK的互作機(jī)制尚不明確。

主要結(jié)果：

已知GLK是葉綠體發(fā)育的主調(diào)控因子，但GLK突變體仍有殘留葉綠素，DAP-Seq證明MYB相關(guān)因子通過直接調(diào)控光合系統(tǒng)組裝和碳代謝基因，彌補(bǔ)了GLK缺失的功能，揭示了葉綠體發(fā)育的雙重調(diào)控機(jī)制。

本文通過DAP-Seq在全基因組范圍內(nèi)鑒定了地錢（Marchantia polymorpha）中MYB相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子MpRR-MYB2和MpRR-MYB5的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果顯示二者分別有6,804個(gè)和2,839個(gè)結(jié)合峰，43%（MpRR-MYB2）和35%（MpRR-MYB5）位于啟動(dòng)子區(qū)域，且共享保守基序TTATC。靶基因功能富集于葉綠素生物合成、光合系統(tǒng)組裝、碳固定和光呼吸通路，且與GLK調(diào)控網(wǎng)絡(luò)存在協(xié)同互作（如MpGLK啟動(dòng)子含MYB結(jié)合位點(diǎn)）。這一結(jié)果系統(tǒng)性揭示了MYB因子在葉綠體發(fā)育中的直接調(diào)控作用，彌補(bǔ)了GLK調(diào)控的空白，是解析葉綠體雙重調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵，為構(gòu)建“MYB-GLK協(xié)同調(diào)控網(wǎng)絡(luò)"提供了分子證據(jù)。隨后通過ChIP-qPCR證實(shí)體內(nèi)結(jié)合，酵母單雜交和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證直接互作，地錢和擬南芥雙突變體表型及跨物種互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)功能保守性。

應(yīng)用場(chǎng)景二：揭示植物脅迫響應(yīng)機(jī)制

案例3：DAP-seq助力揭示提升棉花耐鎘能力的新機(jī)制

發(fā)表時(shí)間：2024年1月

期刊：Plant Biotechnology Journal（IF=13.8）

題目：GhRCD1 promotes cotton tolerance to cadmium by regulating the GhbHLH12–GhMYB44–GhHMA1 transcriptional cascade

研究背景：

鎘是常見有害重金屬，威脅作物與食品安全，易被植物吸收進(jìn)入食物鏈。植物修復(fù)是有效治理途徑，棉花作為非食用經(jīng)濟(jì)作物，修復(fù)土壤鎘污染具天然優(yōu)勢(shì)，可避免鎘進(jìn)入食物鏈，探究其響應(yīng)鎘脅迫的調(diào)控機(jī)制意義重大。

主要結(jié)果：

本文揭示了棉花中GhRCD1通過調(diào)控GhbHLH12–GhMYB44–GhHMA1轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)增強(qiáng)鎘（Cd2?）耐受性的分子機(jī)制。其中通過DAP-Seq在全基因組范圍鑒定了GhMYB44的靶基因網(wǎng)絡(luò)，尤其是重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)基因GhHMA1/5的直接調(diào)控關(guān)系。結(jié)合Y1H、EMSA、雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和遺傳實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了GhMYB44通過G-box元件激活GhHMA1轉(zhuǎn)錄，并與ABA信號(hào)通路協(xié)同調(diào)控棉花Cd2?耐受。DAP-Seq數(shù)據(jù)為解析GhMYB44在Cd2?耐受中的作用提供了分子基礎(chǔ)，補(bǔ)充棉花重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的空白。

案例4：DAP-seq助力解析大麥HvbZIP87基因提高小麥抗病高產(chǎn)的新機(jī)制

發(fā)表時(shí)間：2025年5月

期刊：Journal of Advanced Research（IF=11.4）

題目：Heterologous expression of the barley-specific HvbZIP87 transcription factor in wheat enhances broad-spectrum disease resistance with balanced yield

研究背景：

小麥和大麥等禾本科作物的系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）分子機(jī)制尚不明確，尤其是NPR1與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的互作網(wǎng)絡(luò)在抗病中的作用需進(jìn)一步探究，且開發(fā)新的廣譜抗病基因?qū)π←溈共∮N具有重要意義。

主要結(jié)果：

基于HvNPR1大麥轉(zhuǎn)基因株系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、系統(tǒng)發(fā)育分析及核定位特征，鎖定HvbZIP87為大麥特異性SAR相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。隨后進(jìn)行DAP-seq實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示HvbZIP87直接調(diào)控PR基因和鋅轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因（如TaZIP5、TaZIP9），保守結(jié)合基序?yàn)椤?/span>TGACGTCATCATG"。結(jié)合RNA-seq數(shù)據(jù)，證實(shí)其在無病原物條件下即可激活PR基因表達(dá)，觸發(fā)系統(tǒng)性獲得抗性（SAR）。DAP-seq系統(tǒng)性揭示了HvbZIP87在小麥基因組中的結(jié)合靶點(diǎn)，明確其通過順式元件直接激活PR基因和鋅轉(zhuǎn)運(yùn)基因，而非依賴病原菌誘導(dǎo)，揭示了其調(diào)控小麥抗病性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為功能驗(yàn)證提供了直接依據(jù)。

應(yīng)用場(chǎng)景三：挖掘植物品質(zhì)形成機(jī)制

案例5：DAP-seq技術(shù)助力挖掘水稻香氣形成的關(guān)鍵調(diào)控因子

發(fā)表時(shí)間：2024年11月

期刊：Molecular Plant（IF=17.1）

題目：Volatilome-based GWAS identifies OsWRKY19 and OsNAC021 as key regulators of

rice aroma

研究背景：

香米因其的香味而受到全球的青睞，盡管2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）是水稻香氣的主要成分，但除2-AP外水稻香氣的代謝基礎(chǔ)及香氣代謝物積累的遺傳機(jī)制（除OsBADH2和OsODC外）尚未明確，解析水稻香氣的分子調(diào)控機(jī)制對(duì)香稻品種培育具有重要意義。

主要結(jié)果：

本文通過揮發(fā)組全基因組關(guān)聯(lián)研究（vGWAS）結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，鑒定到兩個(gè)調(diào)控水稻香氣的關(guān)鍵基因：OsWRKY19和OsNAC021。OsWRKY19通過DAP-seq以及ChIP-qPCR、EMSA、雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)被證實(shí)直接結(jié)合OsBADH2啟動(dòng)子的W-box元件（TTGACC/T），抑制其轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)2-AP積累；OsNAC021則通過結(jié)合脂氧合酶（LOX）通路基因（如OsADH1、OsADH2、OsLOX9）啟動(dòng)子的NACRS元件，負(fù)調(diào)控FAVs合成。最終揭示了水稻香氣調(diào)控的雙轉(zhuǎn)錄因子模塊及其機(jī)制。DAP-seq實(shí)驗(yàn)為解析OsWRKY19調(diào)控水稻香氣代謝及農(nóng)藝性狀的分子機(jī)制提供了直接證據(jù)。

案例6：DAP-seq助力揭示軟棗獼猴桃果實(shí)變色機(jī)制

發(fā)表時(shí)間：2025年4月

期刊：Molecular Horticulture（IF=10.6）

題目：Chromosome-level genome assembly assisting for dissecting mechanism of anthocyanin

regulation in kiwifruit (Actinidia arguta)

研究背景：

軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）因果實(shí)富含花青素而受市場(chǎng)歡迎，但其花青素合成的分子調(diào)控機(jī)制尚不明確，且缺乏紅色品種的染色體級(jí)基因組，限制了相關(guān)基因挖掘和分子育種研究。

主要結(jié)果：

本文通過染色體水平的軟棗獼猴桃品種‘天元紅’基因組組裝（N50=21 Mb）及比較基因組分析，結(jié)合RNA-seq篩選到負(fù)調(diào)控花青素合成的bHLH轉(zhuǎn)錄因子AaBEE1。利用DAP-seq在軟棗獼猴桃中鑒定出AaBEE1的457個(gè)高置信度結(jié)合峰，主要分布于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 kb內(nèi)的啟動(dòng)子區(qū)域，保守結(jié)合基序?yàn)?/span>G-box（CACGTG），靶基因顯著富集于類黃酮生物合成通路，其中直接靶向花青素合成關(guān)鍵基因AaLDOX啟動(dòng)子的G-box元件。通過酵母單雜交（Y1H）、電泳遷移率變動(dòng)分析（EMSA）、染色質(zhì)免疫共沉淀PCR（ChIP-qPCR）和雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)（LUC）驗(yàn)證其直接抑制AaLDOX表達(dá)。此外，AaLDOX啟動(dòng)子區(qū)29 bp插入/缺失（Indel）變異與果實(shí)顏色高度關(guān)聯(lián)，攜帶插入變異的紅色品種中AaLDOX啟動(dòng)子活性更高，而缺失變異的綠色品種中AaBEE1結(jié)合增強(qiáng)，抑制基因表達(dá)。本研究構(gòu)建了“AaBEE1-AaLDOX"調(diào)控模塊，DAP-seq是解析AaBEE1調(diào)控機(jī)制的核心技術(shù)，為揭示了軟棗獼猴桃花青素合成的分子機(jī)制提供了關(guān)鍵數(shù)據(jù)。

藍(lán)景科信：提供DAP-seq技術(shù)服務(wù)的優(yōu)質(zhì)合作伙伴

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