2017年發表在Nature上的“Reversing SKI–SMAD4-mediated suppression is essential for TH17 cell differentiation"的文章揭示了TGFβ的“反向調控"策略：正常情況下，SMAD4蛋白與抑制因子SKI形成復合物，像“基因剎車"一樣抑制TH17核心轉錄因子RORγt的表達；而TGFβ通過誘導SKI降解，解除這一抑制，最終激活TH17分化程序。更重要的是，研究發現的SKI-SMAD4 信號軸，為靶向調控TH17細胞提供了全新治療靶點。該研究通過ChIP-seq技術發現SMAD4并非廣泛抑制TH17相關基因，而是特異性結合RORγt基因（Rorc）的啟動子區域，直接抑制其轉錄。

研究背景

TH17細胞在宿主防御、炎癥和自身免疫中至關重要，TGFβ與IL-6協同對TH17細胞分化起重要作用，但TGFβ促進TH17細胞分化的機制尚不清楚。

技術路線

研究結果

本研究首先通過體外分化實驗發現SMAD4缺失的T細胞在僅含IL-6、無TGFβ信號時，仍能高效分化為TH17細胞，而野生型T細胞無法分化；雙敲除小鼠（同時缺失SMAD4和TGFβRII）的T細胞在IL-6單刺激下，TH17相關基因（Rorc、Il17a、Il23r等）表達顯著上調，與SMAD4缺失的T細胞結果一致。進而又進行了體內功能驗證，結果顯示雙敲除小鼠脾臟和淋巴結中TH17細胞比例與野生型相當，而單純TGFβRII敲除小鼠幾乎無TH17細胞。在實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）模型中，雙敲除的T細胞分化為致病性TH17細胞的能力與野生型一致，且小鼠表現出類似的病理損傷。誘導型SMAD4缺失實驗顯示，急性缺失 SMAD4可在無TGFβ受體信號時促進TH17分化，證實SMAD4是抑制TH17分化的關鍵分子。以上結果表明SMAD4缺失解除TGFβ信號依賴的TH17細胞分化抑制。

圖1. SMAD4缺失導致在缺乏TGFβ信號的情況下TH17細胞分化。

圖S1. 在沒有SMAD4的情況下TH17細胞分化。

接下來作者對SMAD4缺失如何影響控制TH 17細胞分化的分子機制進行了研究。利用RNA-seq檢測基因表達差異，結果顯示SMAD4缺失的T細胞激活后12h內，Rorc表達顯著升高，早于其他TH17相關基因（如Il17a、Batf），且RORγt蛋白水平同步上調。回補SMAD4可抑制SMAD4缺失的T細胞Rorc表達及 TH17分化，而異位表達RORγt可逆轉SMAD4的抑制作用，證實了RORγt是SMAD4的關鍵下游靶點。并通過ChIP-seq 進行了驗證，結果顯示SMAD4直接結合Rorc基因的啟動子和增強子區域，但不結合Il17a/Il17f。以上結果表明SMAD4 通過直接抑制RORγt調控TH17分化。

圖2. SMAD4通過直接抑制Rorc表達來控制TH17細胞程序。

圖S2. SMAD4抑制RORγt表達。

以上研究中發現無論是否存在TGFβ，SMAD4仍然與Rorc位點結合，作者提出TGFβ信號通路改變了SMAD4與其他蛋白質的相互作用的假設。通過IP-MS和Co-IP發現，SMAD4與轉錄抑制因子SKI結合，且TGFβ刺激可顯著降低SKI蛋白水平，破壞SKI-SMAD4復合物；SMAD4突變體（無法結合SKI）失去對TH17分化的抑制能力，證實了SKI-SMAD4互作是抑制RORγt的關鍵。接著對SKI的調控機制進行了研究，發現SKI過表達可抑制Rorc啟動子區H3K9乙酰化，而SMAD4缺失可逆轉這一效應，表明SKI-SMAD4復合物通過調控染色質修飾抑制基因表達。經TGFβ處理的野生型T細胞，Rorc啟動子H3K9乙酰化水平升高，而SMAD4缺失的T細胞在無TGFβ時仍維持高乙酰化，進一步證明了TGFβ通過降解SKI解除去乙酰化抑制。以上結果表明，TGFβ通過降解SKI解除SMAD4介導的抑制。

圖3. TGFβ信號破壞SKI-SMAD4復合物，以促進TH17細胞分化。

S3. 低劑量TGFβ下SKI的鑒定及其降解。

最后作者對SKI-SMAD4軸的功能進行了驗證。異位表達SKI可顯著抑制野生型T細胞的TH17 分化和Rorc表達，且該抑制作用依賴SMAD4；干擾SKI表達可使野生型T細胞在無TGFβ時分化為TH17細胞，證明了SKI是TH17分化的負調控因子。體內致病性結果顯示，過表達SKI的T細胞在EAE模型中分化為TH17細胞的能力顯著受損，而SKI缺陷細胞分化增強，表明SKI-SMAD4 軸在體內調控TH17細胞的致病性分化。

圖4. SKI以SMAD4依賴的方式抑制TH17細胞分化。

圖S4. SKI和SMAD4協同抑制TH17細胞分化。

圖S5. TGFβ超家族信號克服了激活T細胞中SKI-SMAD4復合物介導的RORγt表達抑制，以促進TH17細胞分化。

本研究通過基因敲除、分子互作、表觀遺傳及體內外功能實驗，系統性闡明了TGFβ-SKI-SMAD4-RORγt通路在TH17細胞分化中的關鍵機制，為靶向SKI-SMAD4軸治療TH17相關疾病（如自身免疫病）提供理論依據。