對基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的精準(zhǔn)調(diào)控可以定義細(xì)胞的特殊形態(tài)和功能。利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)鑒定差異表達(dá)基因，在轉(zhuǎn)錄水平揭示細(xì)胞多樣性調(diào)控機(jī)制研究已有很多報(bào)道，但是翻譯水平的調(diào)控機(jī)制對細(xì)胞類型影響仍有待闡明。在本文中，作者以果蠅為研究模型，聚焦于頭部的神經(jīng)元細(xì)胞與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。這兩類細(xì)胞都由同一種神經(jīng)干細(xì)胞分化而來，神經(jīng)元細(xì)胞的主要功能是突觸和電信號傳導(dǎo)，而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的作用是形成血腦屏障并充當(dāng)免疫細(xì)胞。盡管兩類細(xì)胞類型不同，它們的轉(zhuǎn)錄組卻具有一定的相似性。
作者分析了RNA-seq和Ribo-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平與核糖體足跡的數(shù)量并不總是匹配的（R2 = 0.664），說明轉(zhuǎn)錄后調(diào)控對于基因表達(dá)也有著重要影響。例如，分別編碼控制鉀離子通道的Shaker(sh)和海藻糖水解酶Trehalase(Treh)在轉(zhuǎn)錄水平上相似，但核糖體足跡結(jié)果顯示Treh具有更高的翻譯效率（TE），這些結(jié)果表明翻譯調(diào)控在果蠅頭部神經(jīng)細(xì)胞的基因表達(dá)中占有重要地位。
圖1. 果蠅頭部轉(zhuǎn)錄組和翻譯組數(shù)據(jù)比較分析
以上結(jié)果只能證明翻譯調(diào)控對不同基因的作用，無法精確到具體細(xì)胞類型。作者進(jìn)一步通過Gal4/UAS系統(tǒng)和nSyb/UAS系統(tǒng)表達(dá)RpL3表位標(biāo)簽標(biāo)記的神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，并提取免疫純化標(biāo)記后的核糖體和相關(guān)mRNA的復(fù)合體，最后成功獲得了果蠅頭部神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的翻譯組數(shù)據(jù)。神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中分別有10821和10994個基因上發(fā)現(xiàn)核糖體足跡，已知的標(biāo)記基因被富集，而非靶標(biāo)記被消耗完。KEGG結(jié)果顯示與細(xì)胞類型已知功能相應(yīng)的核糖體足跡有更好的富集。
作者同時(shí)對FLAG-tag純化的核糖體-RNA復(fù)合體中的RNA進(jìn)行測序，聯(lián)合Ribo-seq結(jié)果對兩種細(xì)胞類型在不同通路上富集程度進(jìn)行了比較。許多具有功能特征的神經(jīng)元基因，如離子通道、G蛋白偶聯(lián)受體、神經(jīng)肽和視覺感知蛋白在神經(jīng)膠質(zhì)中顯示出很低的TE。與轉(zhuǎn)錄水平相比，這些基因在翻譯水平上，神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之間的差異很大。在全基因組維度上，與RNA-seq相比，Ribo-seq數(shù)據(jù)在不同細(xì)胞類型的相關(guān)性更低（R2= 0.59 vs. 0.81）總之，這些數(shù)據(jù)表明翻譯調(diào)節(jié)對塑造細(xì)胞類型特異性蛋白表達(dá)的實(shí)質(zhì)性貢獻(xiàn)。
圖2. 細(xì)胞類型特異性Ribo-seq和RNA-seq揭示不同翻譯調(diào)控機(jī)制
作者通過對差異翻譯轉(zhuǎn)錄本（DTT）上核糖體足跡的分布進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中DTT的翻譯受到抑制，核糖體足跡顯著偏向5’端非翻譯區(qū)（5’-UTR），并且這種模式在全基因組中并不多見。作者推測：神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞通過5’-端uORFs的翻譯來抑制下游ORF的翻譯。此外，根據(jù)對5’-UTR與CDS序列上的密碼子的足跡累計(jì)得分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)AUG及其同源密碼子在5’-UTR上有較高的積累而在CDS中任何密碼子都沒有顯著的積累，并且與神經(jīng)元功能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本通常含有長5’-UTR和上游AUG富集。因此，作者認(rèn)為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是通過uORF將核糖體停滯在5’-UTR上，從而抑制神經(jīng)元相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的翻譯。
圖3. 在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，核糖體在差異翻譯轉(zhuǎn)錄本(DTTs)的5 '端阻滯
圖4. 神經(jīng)膠質(zhì)中AUG上游的足跡積累
這種抑制能否引起細(xì)胞類型差異？作者選擇Rh·1（視紫紅質(zhì)1蛋白）作為重點(diǎn)研究對象。發(fā)現(xiàn)Rh·1的主動翻譯幾乎只能在神經(jīng)元中，并且在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中Rh·1的轉(zhuǎn)錄本上核糖體足跡偏向5’-UTR區(qū)域。作者隨后構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因報(bào)告菌株，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞中Rh·1的蛋白水平顯著低，且與報(bào)告菌株相比，轉(zhuǎn)錄后差異更為顯著。結(jié)果說明神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞通過uUTR區(qū)域選擇性抑制神經(jīng)元基因的蛋白質(zhì)合成，從而增強(qiáng)神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞翻譯組的差異。
圖5. 轉(zhuǎn)基因Rh1-Venus報(bào)告基因揭示了神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的翻譯差異
通過對果蠅大腦中兩種神經(jīng)細(xì)胞的RNA-seq和Ribo-seq分析，作者發(fā)現(xiàn)了大量的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控現(xiàn)象，這些現(xiàn)象放大了細(xì)胞類型的差異。例如，部分基礎(chǔ)蛋白質(zhì)（在多種細(xì)胞類型均能表達(dá)）離子通道和神經(jīng)遞質(zhì)受體等在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中翻譯效率較低，而在神經(jīng)元細(xì)胞中的翻譯效率較高。在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的mRNA中，核糖體足跡分布顯著偏向于5’-UTR，結(jié)合報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果作者推斷uUTR對神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的部分翻譯過程進(jìn)行了選擇性抑制。這些發(fā)現(xiàn)為了解細(xì)胞類型多樣性的調(diào)控的分子機(jī)制提供了新的見解。
核糖體印記測序（Ribosome profile sequencing, Ribo-seq）技術(shù)能夠捕獲正在翻譯過程中與核糖體所結(jié)合的RNA片段，這些片段的長度一般接近30· nt。通過對這部分RNA片段進(jìn)行高通量測序可以精確定位核糖體在翻譯過程中的位置，并提供蛋白質(zhì)合成動態(tài)的信息。將Ribo-seq與RNA-seq測序數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析，可以揭示特定基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯層面上調(diào)控差異及這些調(diào)控對基因表達(dá)的影響。
Ribo-seq的基礎(chǔ)分析
ORF在基因組上的分布統(tǒng)計(jì)與分類
三堿基節(jié)律分析
翻譯基因統(tǒng)計(jì)與表達(dá)量分析
樣本關(guān)系分析
樣本關(guān)系分析
組間差異翻譯基因分析
差異翻譯基因的GO和KEGG功能富集分析
Ribo-seq還可與RNA-seq進(jìn)行聯(lián)合分析
翻譯效率（TE）計(jì)算
Ribo-seq與RNA-seq的相關(guān)性分析
翻譯效率與轉(zhuǎn)錄水平的關(guān)聯(lián)分析
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